抗结核分支杆菌抗体在结核性脑膜炎诊断中的应用
抗结核分支杆菌抗体在结核性脑膜炎诊断中的应用
抗结核分支杆菌抗体在结核性脑膜炎诊断中的应用
中华结核和呼吸感染 1999年第8期第22卷 论著摘要
作者：卢贤瑜 邓一平 陈芳 陶昆 吴立翔 兰景刚
单位：400016 重庆，重庆医科大学临床微生物学、免疫学教研室(吴立翔、兰景刚系检验系学生)
自用酶联免疫吸附试验(ELISA) 检测结核抗原抗体用于结核性脑膜炎（简称结脑）诊断以来，报道检测抗体的较多，而检测抗原的较少。我们分别用三种抗原(BCG、聚合OT、BCG＋PPD)免疫家兔，获得Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ号抗血清，并用于脑脊液（CSF）中结核抗原的检测。
材料与方法 将罗氏培养基上培养的BCG处理后配成湿重80 mg/ml，紫外线杀死细菌，用于免疫家兔。免疫方法：第1次0.2 ml耳静脉注射，第2、3、4次0.5 ml BCG 加不完全福氏佐剂(第3、4次量增加1倍)，皮下多点注射，第5次0.5 ml耳静脉注射。每次间隔2周，末次注射后7～10天放血，分离血清，命为Ⅰ号血清。将OT经透析后用氯甲酸乙酯聚合，测蛋白含量并调配为200 μg/ml。取聚合OT 600 μg另加OT 5 mg(0.14 ml)加福氏完全佐剂3 ml，磁力搅拌器上充分混匀乳化，用于免疫家兔。双侧背部多点皮内注射1 ml，共5次，每次间隔2周，第6次将聚合OT 200 μg/ml调pH为7.2后缓慢静注。7天后放血，分离血清，命为Ⅱ号血清。用制成的湿重为80 mg/ml的BCG，经超声波粉碎后加PPD 1 mg加福氏完全佐剂。免疫家兔，于双后足掌皮下各注射1 ml，第2次双腹股沟淋巴结内各注射0.5 ml，第3次同第1次量，背部皮内多点注射，第4次同第2次，第5次同第3次，第6次用粉碎BCG 1 ml加PPD 0.5 mg静脉缓注,每次间隔2周,末次注射后7天放血分离血清,命为Ⅲ号血清。用双向免疫扩散试验和试管凝集试验鉴定血清效价。
结果 3种血清的效价比较见表1。并用效价较高的Ⅱ、Ⅲ号血清经提纯后，通过ELISA试验（双抗夹心法）检测了临床确诊的结脑38例和29例非结脑患者CSF中结核抗原。每份标本做复孔，平均值为其结果。参考国外的报道以酶标光度计所读A492≥0.20为阳性［1］，检测结果见表2，3。
表1 3种抗血清效价比较
血清号
双扩效价
(PPD)*
凝集效价
Ⅰ
1∶ 4
1∶60
Ⅱ
1∶ 8
1∶100
Ⅲ
1∶16
1∶140
注：*PPD=1 mg/ml表2 Ⅱ号血清检测脑脊液中
结核抗原结果
组别
例数
A值范围
阳性
数
阳性率
(%)
结脑组
38
0.100～0.653
26
68
其他疾病组
29
0～0.147
0
0
表3 Ⅲ号血清检测脑脊液中结核抗原结果
组别
例数
A值范围
阳性
数
阳性率
(%)
结脑组
38
0.160～0.908
31
82
其他疾病组
29
0～0.183
0
0
讨论 从表1中可见Ⅲ号血清双扩效价为1∶16，凝集效价为1∶140，是3种血清中效价最高的。Ⅱ号血清次之，双扩效价为1∶8，凝集效价为1∶100。Ⅰ号血清效价最低，双扩效价为1∶4，凝集效价1∶60。参考国外报道［1］检测结核抗原的抗体大多是兔抗BCG,但无法查到该抗体制备方法。我们反复用不同浓度BCG、灭活和未灭活的BCG及不同的免疫程序免疫家兔，所得抗血清效价均不理想，认为单用BCG为抗原制抗体效果不好。后改用聚合OT(聚合OT的目的是使其分子量增大，增强其抗原性)和BCG＋PPD为抗原免疫家兔,获得了较满意的抗血清Ⅱ号和Ⅲ号。这两种血清比较来看，Ⅲ号血清优于Ⅱ号。而且用这两种血清对67份CSF中结核抗原检测结果的敏感性分别为82％和68％,特异性均为100％。 Ⅲ号血清检测抗原的结果与国外报道基本一致［1］。从此结果中可看出，用Ⅲ号血清检测CSF中结核抗原，完全可以帮助临床上快速诊断结脑。
在研制结核抗体过程中，我们体会到免疫过程较制备其他抗体要长，约2～3个月，甚至更长，效果好些。此外免疫途径用皮内多点注射和淋巴结内注射效果较好。免疫中发现兔子消瘦者较体重变化不大者血清效价要高些，其原因还不太清楚，有待进一步研究。
近年来聚合酶链反应(PCR)技术用于结核分支杆菌的检测报道甚多，但在检测中逐渐发现由于污染、存在扩增抑制物、试剂盒缺乏规范化标准化问题，加之技术条件、质控等方面因素，影响了其敏感性和特异性，而且该项技术需要特殊仪器和试剂，故限制了在基层的推广使用。因此我们认为，探索出较好的制备结核分支杆菌抗体的方法，对于促进用免疫学方法检测结核抗原，帮助临床快速诊断结核病是有重要价值的。
参考文献
1 Watt G, Zaraspe G, Bautista S, et al. Rapid diagnosis of tuberculous meningitis by using enzyme-linked immunosorbent assay to detect mycobacterial antigen and antibody in cerebrospinal fluid. J Infect Dis, 1988, 158:.
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